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Com o desenvolvimento de novos materiais ultramacios para dispositivos médicos e aplicações biomédicas, a caracterização abrangente de suas propriedades físicas e mecânicas é importante e desafiadora.Uma técnica modificada de microscopia de força atômica (AFM) nanoindentação foi aplicada para caracterizar o módulo de superfície extremamente baixo da nova lente de contato biomimética de silicone hidrogel lehfilcon A revestida com uma camada de estruturas de escova de polímero ramificado.Este método permite a determinação precisa dos pontos de contato sem os efeitos da extrusão viscosa ao se aproximar de polímeros ramificados.Além disso, permite determinar as características mecânicas dos elementos individuais da escova sem o efeito da poroelasticidade.Isso é obtido selecionando uma sonda AFM com um design (tamanho da ponta, geometria e taxa de mola) que é particularmente adequado para medir as propriedades de materiais macios e amostras biológicas.Este método melhora a sensibilidade e precisão para medição precisa do material muito macio lehfilcon A, que tem um módulo de elasticidade extremamente baixo na área da superfície (até 2 kPa) e uma elasticidade extremamente alta no ambiente aquoso interno (quase 100%). .Os resultados do estudo da superfície não apenas revelaram as propriedades superficiais ultramacias da lente lehfilcon A, mas também mostraram que o módulo das escovas de polímero ramificado era comparável ao do substrato de silício-hidrogênio.Esta técnica de caracterização de superfície pode ser aplicada a outros materiais ultramacios e dispositivos médicos.
As propriedades mecânicas de materiais projetados para contato direto com tecidos vivos são muitas vezes determinadas pelo ambiente biológico.A combinação perfeita dessas propriedades do material ajuda a alcançar as características clínicas desejadas do material sem causar respostas celulares adversas1,2,3.Para materiais homogêneos a granel, a caracterização das propriedades mecânicas é relativamente fácil devido à disponibilidade de procedimentos padrão e métodos de teste (por exemplo, microindentação4,5,6).No entanto, para materiais ultramacios, como géis, hidrogéis, biopolímeros, células vivas, etc., esses métodos de teste geralmente não são aplicáveis ​​devido a limitações de resolução de medição e à falta de homogeneidade de alguns materiais7.Ao longo dos anos, os métodos tradicionais de indentação foram modificados e adaptados para caracterizar uma ampla gama de materiais macios, mas muitos métodos ainda apresentam sérias deficiências que limitam seu uso8,9,10,11,12,13.A falta de métodos de teste especializados que possam caracterizar com precisão e confiabilidade as propriedades mecânicas de materiais supermacios e camadas superficiais limita severamente seu uso em várias aplicações.
Em nosso trabalho anterior, apresentamos a lente de contato lehfilcon A (CL), um material heterogêneo macio com todas as propriedades de superfície ultramacias derivadas de designs potencialmente biomiméticos inspirados na superfície da córnea do olho.Este biomaterial foi desenvolvido enxertando uma camada polimérica ramificada e reticulada de poli(2-metacriloiloxietilfosforilcolina (MPC)) (PMPC) em um hidrogel de silicone (SiHy) 15 projetado para dispositivos médicos baseados em.Este processo de enxertia cria uma camada na superfície que consiste em uma estrutura de escova polimérica ramificada muito macia e altamente elástica.Nosso trabalho anterior confirmou que a estrutura biomimética do lehfilcon A CL fornece propriedades de superfície superiores, como melhor umectação e prevenção de incrustações, aumento da lubricidade e redução da adesão celular e bacteriana15,16.Além disso, o uso e desenvolvimento deste material biomimético também sugere uma maior expansão para outros dispositivos biomédicos.Portanto, é fundamental caracterizar as propriedades de superfície deste material ultramacio e entender sua interação mecânica com o olho, a fim de criar uma base de conhecimento abrangente para apoiar futuros desenvolvimentos e aplicações.A maioria das lentes de contato SiHy disponíveis comercialmente são compostas por uma mistura homogênea de polímeros hidrofílicos e hidrofóbicos que formam uma estrutura de material uniforme17.Vários estudos foram conduzidos para investigar suas propriedades mecânicas usando métodos tradicionais de teste de compressão, tração e microindentação18,19,20,21.No entanto, o novo design biomimético do lehfilcon A CL o torna um material heterogêneo único, no qual as propriedades mecânicas das estruturas em pincel de polímero ramificado diferem significativamente daquelas do substrato de base SiHy.Portanto, é muito difícil quantificar com precisão essas propriedades usando métodos convencionais e de indentação.Um método promissor usa o método de teste de nanoindentação implementado em microscopia de força atômica (AFM), um método que tem sido usado para determinar as propriedades mecânicas de materiais viscoelásticos macios, como células e tecidos biológicos, bem como polímeros macios22,23,24,25 .,26,27,28,29,30.Na nanoindentação AFM, os fundamentos do teste de nanoindentação são combinados com os últimos avanços na tecnologia AFM para fornecer maior sensibilidade de medição e teste de uma ampla gama de materiais inerentemente supermacios31,32,33,34,35,36.Além disso, a tecnologia oferece outras vantagens importantes por meio do uso de diferentes geometrias.indentador e sonda e a possibilidade de testar em vários meios líquidos.
A nanoindentação AFM pode ser condicionalmente dividida em três componentes principais: (1) equipamentos (sensores, detectores, sondas, etc.);(2) parâmetros de medição (tais como força, deslocamento, velocidade, tamanho da rampa, etc.);(3) Processamento de dados (correção de linha de base, estimativa de ponto de contato, ajuste de dados, modelagem, etc.).Um problema significativo com este método é que vários estudos na literatura usando nanoindentação AFM relatam resultados quantitativos muito diferentes para o mesmo tipo de amostra/célula/material37,38,39,40,41.Por exemplo, Lekka et al.A influência da geometria da sonda AFM no módulo de Young medido de amostras de hidrogel mecanicamente homogêneo e células heterogêneas foi estudada e comparada.Eles relatam que os valores do módulo são altamente dependentes da seleção do cantilever e da forma da ponta, com o valor mais alto para uma sonda em forma de pirâmide e o valor mais baixo de 42 para uma sonda esférica.Da mesma forma, Selhuber-Unkel et al.Foi demonstrado como a velocidade do indentador, o tamanho do indentador e a espessura de amostras de poliacrilamida (PAAM) afetam o módulo de Young medido pela nanoindentação ACM43.Outro fator complicador é a falta de materiais padrão de teste de módulo extremamente baixo e procedimentos de teste gratuitos.Isso torna muito difícil obter resultados precisos com confiança.No entanto, o método é muito útil para medições relativas e avaliações comparativas entre tipos de amostra semelhantes, por exemplo, usando nanoindentação AFM para distinguir células normais de células cancerígenas 44, 45.
Ao testar materiais macios com nanoindentação AFM, uma regra geral é usar uma sonda com uma constante de mola baixa (k) que corresponda ao módulo da amostra e uma ponta hemisférica/redonda para que a primeira sonda não perfure as superfícies da amostra em primeiro contato com materiais macios.Também é importante que o sinal de deflexão gerado pela sonda seja forte o suficiente para ser detectado pelo sistema detector a laser24,34,46,47.No caso de células, tecidos e géis heterogêneos ultramacios, outro desafio é superar a força adesiva entre a sonda e a superfície da amostra para garantir medições reprodutíveis e confiáveis48,49,50.Até recentemente, a maioria dos trabalhos em nanoindentação AFM se concentrava no estudo do comportamento mecânico de células biológicas, tecidos, géis, hidrogéis e biomoléculas usando sondas esféricas relativamente grandes, comumente chamadas de sondas coloidais (CPs)., 47, 51, 52, 53, 54, 55. Essas pontas têm um raio de 1 a 50 µm e são comumente feitas de vidro borosilicato, polimetilmetacrilato (PMMA), poliestireno (PS), dióxido de silício (SiO2) e diamante- como carbono (DLC).Embora a nanoindentação CP-AFM seja frequentemente a primeira escolha para a caracterização de amostras moles, ela tem seus próprios problemas e limitações.O uso de pontas esféricas grandes de tamanho mícron aumenta a área total de contato da ponta com a amostra e resulta em uma perda significativa de resolução espacial.Para espécimes macios e não homogêneos, onde as propriedades mecânicas dos elementos locais podem diferir significativamente da média em uma área mais ampla, a endentação CP pode ocultar qualquer falta de homogeneidade nas propriedades em uma escala local52.As sondas coloidais são normalmente feitas anexando esferas coloidais de tamanho mícron a cantilevers sem ponta usando adesivos epóxi.O próprio processo de fabricação está repleto de muitos problemas e pode levar a inconsistências no processo de calibração da sonda.Além disso, o tamanho e a massa das partículas coloidais afetam diretamente os principais parâmetros de calibração do cantilever, como frequência de ressonância, rigidez da mola e sensibilidade à deflexão56,57,58.Assim, métodos comumente usados ​​para sondas AFM convencionais, como calibração de temperatura, podem não fornecer uma calibração precisa para CP, e outros métodos podem ser necessários para realizar essas correções57, 59, 60, 61. Experimentos típicos de indentação de CP usam grandes desvios cantilever para estudar as propriedades de amostras moles, o que cria outro problema ao calibrar o comportamento não linear do cantilever em desvios relativamente grandes62,63,64.Os métodos modernos de indentação de sondas coloidais geralmente levam em conta a geometria do cantilever usado para calibrar a sonda, mas ignoram a influência de partículas coloidais, o que cria incerteza adicional na precisão do método38,61.Da mesma forma, os módulos elásticos calculados pelo ajuste do modelo de contato dependem diretamente da geometria da sonda de indentação, e a incompatibilidade entre as características da ponta e da superfície da amostra pode levar a imprecisões27, 65, 66, 67, 68. Alguns trabalhos recentes de Spencer et al.Os fatores que devem ser levados em consideração ao caracterizar escovas de polímero macio usando o método de nanoindentação CP-AFM são destacados.Eles relataram que a retenção de um fluido viscoso em escovas de polímero em função da velocidade resulta em um aumento no carregamento da cabeça e, portanto, em diferentes medições das propriedades dependentes da velocidade30,69,70,71.
Neste estudo, caracterizamos o módulo de superfície do material altamente elástico ultramacio lehfilcon A CL usando um método de nanoindentação AFM modificado.Dadas as propriedades e nova estrutura deste material, a faixa de sensibilidade do método tradicional de indentação é claramente insuficiente para caracterizar o módulo deste material extremamente macio, por isso é necessário usar um método de nanoindentação AFM com maior sensibilidade e menor sensibilidade.nível.Depois de revisar as deficiências e problemas das técnicas de nanoindentação de sonda AFM coloidal existentes, mostramos por que escolhemos uma sonda AFM menor e personalizada para eliminar a sensibilidade, o ruído de fundo, identificar o ponto de contato, medir o módulo de velocidade de materiais heterogêneos macios, como retenção de fluidos dependência.e quantificação precisa.Além disso, conseguimos medir com precisão a forma e as dimensões da ponta de indentação, permitindo usar o modelo de ajuste cone-esfera para determinar o módulo de elasticidade sem avaliar a área de contato da ponta com o material.As duas suposições implícitas que são quantificadas neste trabalho são as propriedades totalmente elásticas do material e o módulo independente da profundidade da indentação.Usando esse método, primeiro testamos padrões ultramacios com um módulo conhecido para quantificar o método e, em seguida, usamos esse método para caracterizar as superfícies de dois materiais diferentes para lentes de contato.Espera-se que este método de caracterização de superfícies de nanoindentação AFM com maior sensibilidade seja aplicável a uma ampla gama de materiais ultramacios heterogêneos biomiméticos com uso potencial em dispositivos médicos e aplicações biomédicas.
As lentes de contato Lehfilcon A (Alcon, Fort Worth, Texas, EUA) e seus substratos de silicone hidrogel foram escolhidos para experimentos de nanoindentação.Um suporte de lente especialmente projetado foi usado no experimento.Para instalar a lente para teste, ela foi cuidadosamente colocada no suporte em forma de cúpula, certificando-se de que nenhuma bolha de ar entrasse e, em seguida, fixada com as bordas.Um orifício no acessório na parte superior do suporte da lente fornece acesso ao centro óptico da lente para experimentos de nanoindentação enquanto mantém o líquido no lugar.Isso mantém as lentes totalmente hidratadas.500 μl de solução de embalagem de lentes de contato foi usado como solução de teste.Para verificar os resultados quantitativos, hidrogéis de poliacrilamida não ativada (PAAM) comercialmente disponíveis foram preparados a partir de uma composição de poliacrilamida-co-metileno-bisacrilamida (placas de Petrisoft de 100 mm, Matrigen, Irvine, CA, EUA), um módulo de elasticidade conhecido de 1 kPa.Use 4-5 gotas (aproximadamente 125 µl) de solução salina tamponada com fosfato (PBS da Corning Life Sciences, Tewkesbury, MA, EUA) e 1 gota da solução para lentes de contato OPTI-FREE Puremoist (Alcon, Vaud, TX, EUA).) na interface sonda de hidrogel AFM.
Amostras de substratos Lehfilcon A CL e SiHy foram visualizadas usando um sistema de Microscópio Eletrônico de Varredura de Emissão de Campo FEI Quanta 250 (FEG SEM) equipado com um detector de Microscópio Eletrônico de Transmissão de Varredura (STEM).Para preparar as amostras, as lentes foram primeiro lavadas com água e cortadas em fatias em forma de torta.Para obter um contraste diferencial entre os componentes hidrofílicos e hidrofóbicos das amostras, uma solução estabilizada de RuO4 0,10% foi usada como corante, na qual as amostras foram imersas por 30 min.A coloração lehfilcon A CL RuO4 é importante não apenas para obter contraste diferencial aprimorado, mas também ajuda a preservar a estrutura das escovas de polímero ramificado em sua forma original, que são visíveis nas imagens STEM.Eles foram então lavados e desidratados em uma série de misturas de etanol/água com concentração crescente de etanol.As amostras foram então moldadas com EMBed 812/Araldite epóxi, que curou durante a noite a 70°C.Blocos de amostra obtidos por polimerização de resina foram cortados com um ultramicrótomo, e as finas seções resultantes foram visualizadas com um detector STEM em modo de baixo vácuo em uma tensão de aceleração de 30 kV.O mesmo sistema SEM foi usado para caracterização detalhada da sonda PFQNM-LC-A-CAL AFM (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, EUA).As imagens SEM da sonda AFM foram obtidas em um modo típico de alto vácuo com uma tensão de aceleração de 30 kV.Adquira imagens em diferentes ângulos e ampliações para registrar todos os detalhes da forma e tamanho da ponta da sonda AFM.Todas as dimensões da ponta de interesse nas imagens foram medidas digitalmente.
Um microscópio de força atômica Dimension FastScan Bio Icon (Bruker Nano, Santa Barbara, CA, EUA) com o modo “PeakForce QNM in Fluid” foi usado para visualizar e nanoindentar lehfilcon A CL, substrato SiHy e amostras de hidrogel PAAm.Para experimentos de imagem, uma sonda PEAKFORCE-HIRS-FA (Bruker) com um raio de ponta nominal de 1 nm foi usada para capturar imagens de alta resolução da amostra a uma taxa de varredura de 0,50 Hz.Todas as imagens foram tiradas em solução aquosa.
Os experimentos de nanoindentação AFM foram realizados usando uma sonda PFQNM-LC-A-CAL (Bruker).A sonda AFM tem uma ponta de silício em um cantilever de nitreto de 345 nm de espessura, 54 µm de comprimento e 4,5 µm de largura com uma frequência de ressonância de 45 kHz.Ele é projetado especificamente para caracterizar e realizar medições nanomecânicas quantitativas em amostras biológicas moles.Os sensores são calibrados individualmente na fábrica com configurações de mola pré-calibradas.As constantes de mola das sondas usadas neste estudo estavam na faixa de 0,05–0,1 N/m.Para determinar com precisão a forma e o tamanho da ponta, a sonda foi caracterizada em detalhes usando SEM.Na fig.A Figura 1a mostra uma micrografia eletrônica de varredura de alta resolução e baixa ampliação da sonda PFQNM-LC-A-CAL, fornecendo uma visão holística do projeto da sonda.Na fig.1b mostra uma visão ampliada do topo da ponta da sonda, fornecendo informações sobre a forma e tamanho da ponta.Na extremidade, a agulha é um hemisfério com cerca de 140 nm de diâmetro (Fig. 1c).Abaixo disso, a ponta afunila em uma forma cônica, atingindo um comprimento medido de aproximadamente 500 nm.Fora da região afilada, a ponta é cilíndrica e termina em um comprimento total de ponta de 1,18 µm.Esta é a principal parte funcional da ponta da sonda.Além disso, uma grande sonda esférica de poliestireno (PS) (Novascan Technologies, Inc., Boone, Iowa, EUA) com um diâmetro de ponta de 45 µm e uma constante de mola de 2 N/m também foi usada para testar como uma sonda coloidal.com sonda PFQNM-LC-A-CAL 140 nm para comparação.
Foi relatado que o líquido pode ficar preso entre a sonda AFM e a estrutura da escova de polímero durante a nanoindentação, o que exercerá uma força ascendente na sonda AFM antes que ela realmente toque a superfície69.Este efeito de extrusão viscosa devido à retenção de fluido pode alterar o ponto de contato aparente, afetando assim as medições do módulo de superfície.Para estudar o efeito da geometria da sonda e velocidade de indentação na retenção de fluido, curvas de força de indentação foram plotadas para amostras lehfilcon A CL usando uma sonda de 140 nm de diâmetro em taxas de deslocamento constantes de 1 µm/s e 2 µm/s.diâmetro da sonda 45 µm, configuração de força fixa 6 nN alcançada a 1 µm/s.Experimentos com uma sonda de 140 nm de diâmetro foram realizados a uma velocidade de indentação de 1 µm/s e uma força de ajuste de 300 pN, escolhida para criar uma pressão de contato dentro da faixa fisiológica (1–8 kPa) da pálpebra superior.pressão 72. Amostras macias prontas de hidrogel de PAA com uma pressão de 1 kPa foram testadas para uma força de indentação de 50 pN a uma velocidade de 1 μm/s usando uma sonda com um diâmetro de 140 nm.
Como o comprimento da parte cônica da ponta da sonda PFQNM-LC-A-CAL é de aproximadamente 500 nm, para qualquer profundidade de indentação < 500 nm, pode-se presumir com segurança que a geometria da sonda durante a indentação permanecerá fiel à sua formato de cone.Além disso, assume-se que a superfície do material em teste apresentará uma resposta elástica reversível, o que também será confirmado nas seções a seguir.Portanto, dependendo da forma e tamanho da ponta, escolhemos o modelo de encaixe cone-esfera desenvolvido por Briscoe, Sebastian e Adams, que está disponível no software do fornecedor, para processar nossos experimentos de nanoindentação AFM (NanoScope).Software de análise de dados de separação, Bruker) 73. O modelo descreve a relação força-deslocamento F(δ) para um cone com um defeito de ápice esférico.Na fig.A Figura 2 mostra a geometria de contato durante a interação de um cone rígido com uma ponta esférica, onde R é o raio da ponta esférica, a é o raio de contato, b é o raio de contato na extremidade da ponta esférica, δ é o raio de contato.profundidade de indentação, θ é o meio-ângulo do cone.A imagem SEM desta sonda mostra claramente que a ponta esférica de 140 nm de diâmetro se funde tangencialmente em um cone, então aqui b é definido apenas por R, ou seja, b = R cos θ.O software fornecido pelo fornecedor fornece uma relação cone-esfera para calcular os valores do módulo de Young (E) a partir dos dados de separação de força assumindo a > b.Relação:
onde F é a força de indentação, E é o módulo de Young, ν é a razão de Poisson.O raio de contato a pode ser estimado usando:
Esquema da geometria de contato de um cone rígido com uma ponta esférica pressionada no material de uma lente de contato Lefilcon com uma camada superficial de escovas de polímero ramificado.
Se a ≤ b, a relação se reduz à equação de um penetrador esférico convencional;
Acreditamos que a interação da sonda de indentação com a estrutura ramificada da escova de polímero PMPC fará com que o raio de contato a seja maior que o raio de contato esférico b.Portanto, para todas as medidas quantitativas do módulo de elasticidade realizadas neste estudo, utilizamos a dependência obtida para o caso a > b.
Os materiais biomiméticos ultramacios estudados neste estudo foram amplamente fotografados usando microscopia eletrônica de transmissão de varredura (STEM) da seção transversal da amostra e microscopia de força atômica (AFM) da superfície.Esta caracterização detalhada da superfície foi realizada como uma extensão do nosso trabalho publicado anteriormente, no qual determinamos que a estrutura em escova polimérica ramificada dinamicamente da superfície lehfilcon A CL modificada por PMPC exibia propriedades mecânicas semelhantes ao tecido corneano nativo 14 .Por esta razão, nos referimos às superfícies das lentes de contato como materiais biomiméticos14.Na fig.3a, b mostram seções transversais de estruturas de escova de polímero PMPC ramificadas na superfície de um substrato lehfilcon A CL e um substrato SiHy não tratado, respectivamente.As superfícies de ambas as amostras foram posteriormente analisadas usando imagens AFM de alta resolução, que confirmaram ainda mais os resultados da análise STEM (Fig. 3c, d).Tomadas em conjunto, essas imagens fornecem um comprimento aproximado da estrutura de pincel de polímero ramificado PMPC em 300–400 nm, o que é crítico para interpretar as medições de nanoindentação AFM.Outra observação importante derivada das imagens é que a estrutura geral da superfície do material biomimético CL é morfologicamente diferente daquela do material de substrato SiHy.Essa diferença em sua morfologia de superfície pode se tornar aparente durante sua interação mecânica com a sonda de indentação AFM e subsequentemente nos valores de módulo medidos.
Imagens STEM transversais de (a) lehfilcon A CL e (b) substrato SiHy.Barra de escala, 500 nm.Imagens AFM da superfície do substrato lehfilcon A CL (c) e do substrato base SiHy (d) (3 µm × 3 µm).
Polímeros bioinspirados e estruturas de escova de polímero são inerentemente macios e têm sido amplamente estudados e usados ​​em várias aplicações biomédicas74,75,76,77.Portanto, é importante usar o método de nanoindentação AFM, que pode medir com precisão e confiabilidade suas propriedades mecânicas.Mas, ao mesmo tempo, as propriedades exclusivas desses materiais ultramacios, como módulo de elasticidade extremamente baixo, alto teor de líquido e alta elasticidade, muitas vezes dificultam a escolha do material, forma e formato corretos da sonda de indentação.tamanho.Isso é importante para que o penetrador não perfure a superfície macia da amostra, o que levaria a erros na determinação do ponto de contato com a superfície e na área de contato.
Para isso, uma compreensão abrangente da morfologia de materiais biomiméticos ultramacios (lehfilcon A CL) é essencial.As informações sobre o tamanho e a estrutura das escovas de polímero ramificado obtidas pelo método de imagem fornecem a base para a caracterização mecânica da superfície usando técnicas de nanoindentação AFM.Em vez de sondas coloidais esféricas de tamanho mícron, escolhemos a sonda de nitreto de silício PFQNM-LC-A-CAL (Bruker) com diâmetro de ponta de 140 nm, especialmente projetada para mapeamento quantitativo das propriedades mecânicas de amostras biológicas 78, 79, 80 , 81, 82, 83, 84 A justificativa para usar sondas relativamente afiadas em comparação com sondas coloidais convencionais pode ser explicada pelas características estruturais do material.Comparando o tamanho da ponta da sonda (~140 nm) com as escovas de polímero ramificado na superfície de CL lehfilcon A, mostrado na Fig. 3a, pode-se concluir que a ponta é grande o suficiente para entrar em contato direto com essas estruturas de escova, que reduz a chance da ponta perfurá-los.Para ilustrar este ponto, na Fig. 4 está uma imagem STEM do lehfilcon A CL e a ponta de indentação da sonda AFM (desenhada em escala).
Esquema mostrando imagem STEM de lehfilcon A CL e uma sonda de indentação ACM (desenhada em escala).
Além disso, o tamanho da ponta de 140 nm é pequeno o suficiente para evitar o risco de qualquer um dos efeitos de extrusão pegajosa relatados anteriormente para escovas de polímero produzidas pelo método de nanoindentação CP-AFM69,71.Assumimos que, devido à forma especial de cone esférico e ao tamanho relativamente pequeno desta ponta AFM (Fig. 1), a natureza da curva de força gerada pela nanoindentação lehfilcon A CL não dependerá da velocidade de indentação ou da velocidade de carga/descarga .Portanto, não é afetado por efeitos poroelásticos.Para testar esta hipótese, as amostras lehfilcon A CL foram indentadas em uma força máxima fixa usando uma sonda PFQNM-LC-A-CAL, mas em duas velocidades diferentes, e as curvas de força de tração e retração resultantes foram usadas para plotar a força (nN) em separação (µm) é mostrado na Figura 5a.É claro que as curvas de força durante o carregamento e descarregamento se sobrepõem completamente, e não há evidência clara de que a força de cisalhamento na profundidade de indentação zero aumenta com a velocidade de indentação na figura, sugerindo que os elementos individuais da escova foram caracterizados sem um efeito poroelástico.Em contraste, os efeitos de retenção de fluido (extrusão viscosa e efeitos de poroelasticidade) são evidentes para a sonda AFM de 45 µm de diâmetro na mesma velocidade de indentação e são destacados pela histerese entre as curvas de estiramento e retração, conforme mostrado na Figura 5b.Esses resultados apóiam a hipótese e sugerem que sondas de 140 nm de diâmetro são uma boa escolha para caracterizar essas superfícies macias.
curvas de força de indentação lehfilcon A CL usando ACM;(a) usando uma sonda com diâmetro de 140 nm em duas taxas de carregamento, demonstrando a ausência de efeito poroelástico durante a indentação da superfície;(b) usando sondas com diâmetro de 45 µm e 140 nm.s mostram os efeitos da extrusão viscosa e da poroelasticidade para sondas grandes em comparação com sondas menores.
Para caracterizar superfícies ultramacias, os métodos de nanoindentação AFM devem ter a melhor sonda para estudar as propriedades do material em estudo.Além do formato e tamanho da ponta, a sensibilidade do sistema detector AFM, a sensibilidade à deflexão da ponta no ambiente de teste e a rigidez do cantilever desempenham um papel importante na determinação da precisão e confiabilidade da nanoindentação.Medidas.Para o nosso sistema AFM, o limite de detecção do detector sensível à posição (PSD) é de aproximadamente 0,5 mV e é baseado na taxa de mola pré-calibrada e na sensibilidade de deflexão de fluido calculada da sonda PFQNM-LC-A-CAL, que corresponde ao sensibilidade de carga teórica.é inferior a 0,1 pN.Portanto, este método permite a medição de uma força de indentação mínima ≤ 0,1 pN sem qualquer componente de ruído periférico.No entanto, é quase impossível para um sistema AFM reduzir o ruído periférico a esse nível devido a fatores como vibração mecânica e dinâmica de fluidos.Esses fatores limitam a sensibilidade geral do método de nanoindentação AFM e também resultam em um sinal de ruído de fundo de aproximadamente ≤ 10 pN.Para a caracterização da superfície, as amostras de substrato lehfilcon A CL e SiHy foram indentadas sob condições totalmente hidratadas usando uma sonda de 140 nm para caracterização SEM, e as curvas de força resultantes foram sobrepostas entre força (pN) e pressão.O gráfico de separação (µm) é mostrado na Figura 6a.Em comparação com o substrato de base SiHy, a curva de força lehfilcon A CL mostra claramente uma fase de transição começando no ponto de contato com a escova de polímero bifurcado e terminando com uma mudança acentuada na inclinação marcando o contato da ponta com o material subjacente.Esta parte de transição da curva de força destaca o comportamento verdadeiramente elástico da escova de polímero ramificado na superfície, conforme evidenciado pela curva de compressão seguindo de perto a curva de tensão e o contraste nas propriedades mecânicas entre a estrutura da escova e o material SiHy volumoso.Ao comparar lefilcon.Separação do comprimento médio de um pincel de polímero ramificado na imagem STEM do PCS (Fig. 3a) e sua curva de força ao longo da abcissa na Fig. 3a.6a mostra que o método é capaz de detectar a ponta e o polímero ramificado atingindo o topo da superfície.Contato entre as estruturas da escova.Além disso, a sobreposição próxima das curvas de força indica nenhum efeito de retenção de líquido.Neste caso, não há absolutamente nenhuma adesão entre a agulha e a superfície da amostra.As seções superiores das curvas de força para as duas amostras se sobrepõem, refletindo a semelhança das propriedades mecânicas dos materiais do substrato.
(a) Curvas de força de nanoindentação AFM para substratos lehfilcon A CL e substratos SiHy, (b) curvas de força mostrando estimativa de ponto de contato usando o método de limite de ruído de fundo.
A fim de estudar os detalhes mais finos da curva de força, a curva de tensão da amostra lehfilcon A CL é plotada novamente na Fig. 6b com uma força máxima de 50 pN ao longo do eixo y.Este gráfico fornece informações importantes sobre o ruído de fundo original.O ruído está na faixa de ±10 pN, que é usado para determinar com precisão o ponto de contato e calcular a profundidade de indentação.Conforme relatado na literatura, a identificação dos pontos de contato é fundamental para avaliar com precisão as propriedades do material, como o módulo85.Uma abordagem envolvendo processamento automático de dados de curva de força mostrou um ajuste melhorado entre ajuste de dados e medições quantitativas para materiais macios86.Neste trabalho, nossa escolha de pontos de contato é relativamente simples e objetiva, mas tem suas limitações.Nossa abordagem conservadora para determinar o ponto de contato pode resultar em valores de módulo ligeiramente superestimados para profundidades de indentação menores (< 100 nm).O uso de detecção de ponto de contato baseada em algoritmo e processamento automatizado de dados pode ser uma continuação deste trabalho no futuro para melhorar ainda mais nosso método.Assim, para ruído de fundo intrínseco da ordem de ±10 pN, definimos o ponto de contato como o primeiro ponto de dados no eixo x na Figura 6b com um valor de ≥10 pN.Então, de acordo com o limite de ruído de 10 pN, uma linha vertical no nível de ~0,27 µm marca o ponto de contato com a superfície, após o qual a curva de alongamento continua até que o substrato atinja a profundidade de indentação de ~270 nm.Curiosamente, com base no tamanho das características de pincel de polímero ramificado (300–400 nm) medidas usando o método de imagem, a profundidade de indentação da amostra CL lehfilcon A observada usando o método de limite de ruído de fundo é de cerca de 270 nm, que é muito próximo de o tamanho de medição com STEM.Estes resultados confirmam ainda mais a compatibilidade e aplicabilidade da forma e tamanho da ponta da sonda AFM para indentação desta estrutura de escova de polímero ramificado muito macia e altamente elástica.Esses dados também fornecem fortes evidências para apoiar nosso método de usar o ruído de fundo como um limite para identificar pontos de contato.Assim, quaisquer resultados quantitativos obtidos a partir de modelagem matemática e ajuste de curva de força devem ser relativamente precisos.
Medições quantitativas por métodos de nanoindentação AFM são completamente dependentes dos modelos matemáticos usados ​​para seleção de dados e posterior análise.Portanto, é importante considerar todos os fatores relacionados à escolha do penetrador, propriedades do material e a mecânica de sua interação antes de escolher um determinado modelo.Neste caso, a geometria da ponta foi cuidadosamente caracterizada usando micrografias SEM (Fig. 1) e, com base nos resultados, a sonda de nanoindentação AFM de 140 nm de diâmetro com um cone duro e geometria de ponta esférica é uma boa escolha para caracterizar amostras lehfilcon A CL79 .Outro fator importante que precisa ser avaliado com cuidado é a elasticidade do material polimérico que está sendo testado.Embora os dados iniciais da nanoindentação (Figs. 5a e 6a) delineiem claramente as características da sobreposição das curvas de tensão e compressão, ou seja, a completa recuperação elástica do material, é de extrema importância confirmar a natureza puramente elástica dos contatos .Para este fim, duas indentações sucessivas foram realizadas no mesmo local na superfície da amostra lehfilcon A CL a uma taxa de indentação de 1 µm/s sob condições de hidratação total.Os dados da curva de força resultante são mostrados na fig.7 e, como esperado, as curvas de expansão e compressão das duas impressões são quase idênticas, destacando a alta elasticidade da estrutura do pincel de polímero ramificado.
Duas curvas de força de indentação no mesmo local na superfície do lehfilcon A CL indicam a elasticidade ideal da superfície da lente.
Com base nas informações obtidas das imagens SEM e STEM da ponta da sonda e da superfície lehfilcon A CL, respectivamente, o modelo cone-esfera é uma representação matemática razoável da interação entre a ponta da sonda AFM e o material polimérico macio que está sendo testado.Além disso, para este modelo de cone-esfera, as suposições fundamentais sobre as propriedades elásticas do material impresso são verdadeiras para este novo material biomimético e são usadas para quantificar o módulo de elasticidade.
Após uma avaliação abrangente do método de nanoindentação AFM e seus componentes, incluindo propriedades da sonda de indentação (formato, tamanho e rigidez da mola), sensibilidade (ruído de fundo e estimativa do ponto de contato) e modelos de ajuste de dados (medidas quantitativas do módulo), o método foi usado.caracterize amostras ultramacias disponíveis comercialmente para verificar resultados quantitativos.Um hidrogel comercial de poliacrilamida (PAAM) com um módulo de elasticidade de 1 kPa foi testado sob condições de hidratação usando uma sonda de 140 nm.Os detalhes dos testes e cálculos do módulo são fornecidos nas Informações Suplementares.Os resultados mostraram que o módulo médio medido foi de 0,92 kPa, e o %RSD e o desvio percentual (%) do módulo conhecido foram inferiores a 10%.Esses resultados confirmam a precisão e reprodutibilidade do método de nanoindentação AFM usado neste trabalho para medir os módulos de materiais ultramacios.As superfícies das amostras lehfilcon A CL e o substrato de base SiHy foram posteriormente caracterizadas usando o mesmo método de nanoindentação AFM para estudar o módulo de contato aparente da superfície ultramacia em função da profundidade de indentação.Curvas de separação de força de indentação foram geradas para três espécimes de cada tipo (n = 3; uma indentação por espécime) a uma força de 300 pN, uma velocidade de 1 µm/s e hidratação total.A curva de compartilhamento de força de indentação foi aproximada usando um modelo cone-esfera.Para obter o módulo dependente da profundidade de indentação, uma porção de 40 nm de largura da curva de força foi definida a cada incremento de 20 nm a partir do ponto de contato e mediu os valores do módulo em cada etapa da curva de força.Spin Cy et ai.Uma abordagem semelhante foi usada para caracterizar o gradiente de módulo de escovas de polímero de poli(lauril metacrilato) (P12MA) usando nanoindentação de sonda AFM coloidal, e eles são consistentes com os dados usando o modelo de contato Hertz.Esta abordagem fornece um gráfico de módulo de contato aparente (kPa) versus profundidade de indentação (nm), conforme mostrado na Figura 8, que ilustra o gradiente de profundidade/módulo de contato aparente.O módulo de elasticidade calculado da amostra CL lehfilcon A está na faixa de 2–3 kPa dentro dos 100 nm superiores da amostra, além do qual começa a aumentar com a profundidade.Por outro lado, ao testar o substrato de base SiHy sem um filme tipo pincel na superfície, a profundidade máxima de indentação alcançada a uma força de 300 pN é inferior a 50 nm e o valor do módulo obtido a partir dos dados é de cerca de 400 kPa , que é comparável aos valores do módulo de Young para materiais a granel.
Módulo de contato aparente (kPa) vs. profundidade de indentação (nm) para substratos lehfilcon A CL e SiHy usando o método de nanoindentação AFM com geometria cone-esfera para medir o módulo.
A superfície superior da nova estrutura de escova de polímero ramificado biomimético exibe um módulo de elasticidade extremamente baixo (2-3 kPa).Isso corresponderá à extremidade suspensa livre da escova de polímero bifurcada, conforme mostrado na imagem do STEM.Embora haja alguma evidência de um gradiente de módulo na borda externa do CL, o principal substrato de alto módulo é mais influente.No entanto, os 100 nm superiores da superfície estão dentro de 20% do comprimento total da escova de polímero ramificado, portanto, é razoável supor que os valores medidos do módulo nessa faixa de profundidade de indentação são relativamente precisos e não fortemente dependem do efeito do objeto inferior.
Devido ao design biomimético exclusivo das lentes de contato lehfilcon A, que consistem em estruturas de escova de polímero PMPC ramificadas enxertadas na superfície de substratos SiHy, é muito difícil caracterizar com segurança as propriedades mecânicas de suas estruturas de superfície usando métodos de medição tradicionais.Aqui apresentamos um método avançado de nanoindentação AFM para caracterizar com precisão materiais ultramacios, como lefilcon A, com alto teor de água e elasticidade extremamente alta.Este método é baseado no uso de uma sonda AFM cujo tamanho de ponta e geometria são cuidadosamente escolhidos para corresponder às dimensões estruturais das características da superfície ultramacia a serem impressas.Essa combinação de dimensões entre a sonda e a estrutura fornece maior sensibilidade, permitindo-nos medir o baixo módulo e as propriedades elásticas inerentes dos elementos de pincel de polímero ramificado, independentemente dos efeitos poroelásticos.Os resultados mostraram que as escovas de polímero PMPC ramificadas exclusivas características da superfície da lente tinham um módulo de elasticidade extremamente baixo (até 2 kPa) e elasticidade muito alta (quase 100%) quando testadas em um ambiente aquoso.Os resultados da nanoindentação AFM também nos permitiram caracterizar o módulo de contato aparente/gradiente de profundidade (30 kPa/200 nm) da superfície da lente biomimética.Este gradiente pode ser devido à diferença de módulo entre as escovas de polímero ramificado e o substrato SiHy, ou a estrutura/densidade ramificada das escovas de polímero, ou uma combinação dos mesmos.No entanto, estudos mais aprofundados são necessários para entender completamente a relação entre estrutura e propriedades, especialmente o efeito da ramificação do pincel nas propriedades mecânicas.Medições semelhantes podem ajudar a caracterizar as propriedades mecânicas da superfície de outros materiais ultramacios e dispositivos médicos.
Os conjuntos de dados gerados e/ou analisados ​​durante o estudo atual estão disponíveis com os respectivos autores mediante solicitação razoável.
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